A atividade da polimerase de DNA Taq Plus de 1 unidade (U) é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar desoxinucleotídeos 10 nmol em substâncias insolúveis em ácido a 74 ° C em 30 min usando DNA de esperma de salmão ativado como molde / primer.
A pureza pela detecção de SDS-PAGE é superior a 99%; Nenhuma atividade de nuclease exógena é detectada; O gene de cópia única no genoma humano pode ser amplificado de forma eficaz; Nenhuma mudança significativa na atividade quando armazenado em temperatura ambiente por uma semana.
A polimerase de DNA Taq Plus tem atividade de exonuclease 5'-3 'e atividade de exonuclease 3'-5'. Os produtos de PCR podem ser clonados diretamente no vetor TA. Se a eficiência da clonagem precisar ser melhorada, é recomendado purificar os produtos de PCR primeiro e realizar a cauda A antes de clonar no vetor TA.
Mistura de PCR Taq Plus de um tubo (certificação nacional de produtos de alta tecnologia)
■ O Taq Plus PCR Mix melhorou a especificidade e a sensibilidade da reação de PCR e pode amplificar modelos complexos com alto conteúdo de GC, estrutura secundária e semelhantes. Apenas 2 cópias do modelo alvo podem ser amplificadas, garantindo resultados experimentais mais precisos.
■ A fórmula única do Taq Plus PCR Mix torna todo o sistema de reação muito estável e a atividade não será afetada por congelamento / descongelamento repetido ou armazenamento a longo prazo a 4 ° C.
■ A solução de mistura de PCR pré-preparada estável e eficiente pode tornar a operação rápida e simples, reduzindo muito a intensidade do trabalho e os erros de amostragem. O intensificador e otimizador de PCR de alto desempenho também estão incluídos na mistura, o que reduz os requisitos das condições de PCR.
■ Este produto possui sistemas com e sem corantes. Os produtos da mistura de PCR contendo corante podem ser submetidos à eletroforese diretamente após a PCR, sem adição de tampão de amostra.
É comumente usado para amplificação de modelos com alta fidelidade e estrutura complexa, como alto conteúdo de GC e estrutura secundária. Na maioria dos casos, pode substituir a Taq DNA polimerase.
Todos os produtos podem ser personalizados para ODM / OEM. Para detalhes,clique em Serviço personalizado (ODM / OEM)
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Use DNA genômico como molde para amplificar o fragmento de 1 kb. Após a reação de PCR, leve 5 μl para detecção de eletroforese. |
Modelo A-1
■ O modelo contém impurezas de proteínas ou inibidores Taq, etc. —— Purifique o modelo de DNA, remova as impurezas de proteínas ou extraia o DNA do modelo com kits de purificação.
■ A desnaturação do modelo não está completa —— Aumente apropriadamente a temperatura de desnaturação e prolongue o tempo de desnaturação.
■ Degradação do modelo ——Reprepare o modelo.
A-2 Primer
■ Baixa qualidade dos primers —— Sintetize novamente o primer.
■ Degradação do primer —— Aliquote os primers de alta concentração em um pequeno volume para preservação. Evite congelamento e descongelamento múltiplo ou criopreservação de 4 ° C por longo prazo.
■ Projeto inadequado de primers (por exemplo, o comprimento do primer não é suficiente, dímero formado entre os primers, etc.) -Redesign primers (evita a formação de primer dímero e estrutura secundária)
A-3 Mg2+concentração
■ Mg2+ a concentração está muito baixa —— Aumente o Mg de maneira adequada2+ concentração: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
Temperatura de recozimento A-4
■ A alta temperatura de recozimento afeta a ligação do primer e do template. ——Reduza a temperatura de recozimento e otimize a condição com um gradiente de 2 ° C.
Tempo de extensão A-5
■ Tempo de extensão curto —— Aumente o tempo de extensão.
Fenômenos: Amostras negativas também mostram as bandas da sequência alvo.
Contaminação A-1 de PCR
■ Contaminação cruzada da sequência-alvo ou produtos de amplificação ——Cuidado para não pipetar a amostra que contém a sequência-alvo na amostra negativa ou derramar para fora do tubo de centrífuga. Os reagentes ou equipamentos devem ser autoclavados para eliminar os ácidos nucléicos existentes, e a existência de contaminação deve ser determinada por meio de experimentos de controle negativo.
■ Contaminação do reagente —— Aliquote os reagentes e armazene-os em temperatura baixa.
A-2 Primer
■ Mg2+ a concentração está muito baixa —— Aumente o Mg de maneira adequada2+ concentração: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
■ Projeto de primer impróprio e a sequência alvo tem homologia com a sequência não alvo. —— Refaça os primers.
Fenômenos: As bandas de amplificação de PCR são inconsistentes com o tamanho esperado, seja grande ou pequeno, ou às vezes ocorrem bandas de amplificação específicas e bandas de amplificação não específicas.
A-1 Primer
■ Baixa especificidade do primer
—— Primer de redesenho.
■ A concentração do primer está muito alta —— Aumente adequadamente a temperatura de desnaturação e prolongue o tempo de desnaturação.
A-2 Mg2+ concentração
■ O Mg2+ a concentração é muito alta —— Reduza adequadamente a concentração de Mg2 +: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
Polimerase A-3 Termostável
■ Quantidade excessiva de enzima - reduza a quantidade de enzima de forma adequada em intervalos de 0,5 U.
Temperatura de recozimento A-4
■ A temperatura de recozimento está muito baixa —— Aumente apropriadamente a temperatura de recozimento ou adote o método de recozimento de dois estágios
Ciclos de PCR A-5
■ Muitos ciclos de PCR —— Reduza o número de ciclos de PCR.
A-1 Primer—— Especificidade pobre —— Desenhe novamente o primer, mude a posição e o comprimento do primer para aumentar sua especificidade; ou realizar PCR aninhado.
DNA de modelo A-2
——O modelo não é puro —— Purifique o modelo ou extraia o DNA com kits de purificação.
A-3 Mg2+ concentração
——Mg2+ a concentração é muito alta —— Reduza o Mg de maneira adequada2+ concentração: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
A-4 dNTP
—— A concentração de dNTPs está muito alta —— Reduza a concentração de dNTP de forma adequada
Temperatura de recozimento A-5
—— Temperatura de recozimento muito baixa —— Aumente apropriadamente a temperatura de recozimento
Ciclos A-6
—— Muitos ciclos —— Otimize o número do ciclo
O primeiro passo é escolher a polimerase apropriada. A polimerase Taq regular não pode ser revisada devido à falta de atividade da exonuclease 3'-5 'e a incompatibilidade reduzirá muito a eficiência de extensão dos fragmentos. Portanto, a polimerase Taq regular não pode amplificar com eficácia fragmentos alvo maiores que 5 kb. A polimerase Taq com modificação especial ou outra polimerase de alta fidelidade deve ser selecionada para melhorar a eficiência da extensão e atender às necessidades de amplificação de fragmentos longos. Além disso, a amplificação de fragmentos longos também requer o ajuste correspondente do desenho do primer, tempo de desnaturação, tempo de extensão, pH do tampão, etc. Normalmente, os primers com 18-24 bp podem levar a um melhor rendimento. A fim de evitar danos ao molde, o tempo de desnaturação a 94 ° C deve ser reduzido para 30 segundos ou menos por ciclo, e o tempo para aumentar a temperatura para 94 ° C antes da amplificação deve ser inferior a 1 minuto. Além disso, definir a temperatura de extensão em cerca de 68 ° C e projetar o tempo de extensão de acordo com a taxa de 1 kb / min pode garantir a amplificação eficaz de fragmentos longos.
A taxa de erro de amplificação por PCR pode ser reduzida usando várias DNA polimerases com alta fidelidade. Entre todas as Taq DNA polimerases encontradas até agora, a enzima Pfu tem a menor taxa de erro e a maior fidelidade (ver tabela anexa). Além da seleção da enzima, os pesquisadores podem reduzir ainda mais a taxa de mutação da PCR otimizando as condições de reação, incluindo a otimização da composição do tampão, a concentração da polimerase termoestável e a otimização do número do ciclo da PCR.
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