2 × Pfu PCR Mix

Modelo A-1

■ O modelo contém impurezas de proteínas ou inibidores Taq, etc. —— Purifique o modelo de DNA, remova as impurezas de proteínas ou extraia o DNA do modelo com kits de purificação.

■ A desnaturação do modelo não está completa —— Aumente apropriadamente a temperatura de desnaturação e prolongue o tempo de desnaturação.

■ Degradação do modelo ——Reprepare o modelo.

A-2 Primer

■ Baixa qualidade dos primers —— Sintetize novamente o primer.

■ Degradação do primer —— Aliquote os primers de alta concentração em um pequeno volume para preservação. Evite congelamento e descongelamento múltiplo ou criopreservação de 4 ° C por longo prazo.

■ Projeto inadequado de primers (por exemplo, o comprimento do primer não é suficiente, dímero formado entre os primers, etc.) -Redesign primers (evita a formação de primer dímero e estrutura secundária)

A-3 Mg²⁺concentração

■ Mg²⁺ a concentração está muito baixa —— Aumente o Mg de maneira adequada²⁺ concentração: Otimize o Mg²⁺ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal²⁺ concentração para cada molde e primer.

Temperatura de recozimento A-4

■ A alta temperatura de recozimento afeta a ligação do primer e do template. ——Reduza a temperatura de recozimento e otimize a condição com um gradiente de 2 ° C.

Tempo de extensão A-5

■ Tempo de extensão curto —— Aumente o tempo de extensão.

Fenômenos: Amostras negativas também mostram as bandas da sequência alvo.

Contaminação A-1 de PCR

■ Contaminação cruzada da sequência-alvo ou produtos de amplificação ——Cuidado para não pipetar a amostra que contém a sequência-alvo na amostra negativa ou derramar para fora do tubo de centrífuga. Os reagentes ou equipamentos devem ser autoclavados para eliminar os ácidos nucléicos existentes, e a existência de contaminação deve ser determinada por meio de experimentos de controle negativo.

■ Contaminação do reagente —— Aliquote os reagentes e armazene-os em temperatura baixa.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ a concentração está muito baixa —— Aumente o Mg de maneira adequada²⁺ concentração: Otimize o Mg²⁺ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal²⁺ concentração para cada molde e primer.

■ Projeto de primer impróprio e a sequência alvo tem homologia com a sequência não alvo. —— Refaça os primers.

Fenômenos: As bandas de amplificação de PCR são inconsistentes com o tamanho esperado, seja grande ou pequeno, ou às vezes ocorrem bandas de amplificação específicas e bandas de amplificação não específicas.

A-1 Primer

■ Baixa especificidade do primer

—— Primer de redesenho.

■ A concentração do primer está muito alta —— Aumente adequadamente a temperatura de desnaturação e prolongue o tempo de desnaturação.

A-2 Mg²⁺ concentração

■ O Mg²⁺ a concentração é muito alta —— Reduza adequadamente a concentração de Mg2 +: Otimize o Mg²⁺ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal²⁺ concentração para cada molde e primer.

Polimerase A-3 Termostável

■ Quantidade excessiva de enzima - reduza a quantidade de enzima de forma adequada em intervalos de 0,5 U.

Temperatura de recozimento A-4

■ A temperatura de recozimento está muito baixa —— Aumente apropriadamente a temperatura de recozimento ou adote o método de recozimento de dois estágios

Ciclos de PCR A-5

■ Muitos ciclos de PCR —— Reduza o número de ciclos de PCR.

A-1 Primer—— Especificidade pobre —— Desenhe novamente o primer, mude a posição e o comprimento do primer para aumentar sua especificidade; ou realizar PCR aninhado.

DNA de modelo A-2

——O modelo não é puro —— Purifique o modelo ou extraia o DNA com kits de purificação.

A-3 Mg²⁺ concentração

——Mg²⁺ a concentração é muito alta —— Reduza o Mg de maneira adequada²⁺ concentração: Otimize o Mg²⁺ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal²⁺ concentração para cada molde e primer.

A-4 dNTP

—— A concentração de dNTPs está muito alta —— Reduza a concentração de dNTP de forma adequada

Temperatura de recozimento A-5

—— Temperatura de recozimento muito baixa —— Aumente apropriadamente a temperatura de recozimento

Ciclos A-6

—— Muitos ciclos —— Otimize o número do ciclo

O primeiro passo é escolher a polimerase apropriada. A polimerase Taq regular não pode ser revisada devido à falta de atividade da exonuclease 3'-5 'e a incompatibilidade reduzirá muito a eficiência de extensão dos fragmentos. Portanto, a polimerase Taq regular não pode amplificar com eficácia fragmentos alvo maiores que 5 kb. A polimerase Taq com modificação especial ou outra polimerase de alta fidelidade deve ser selecionada para melhorar a eficiência da extensão e atender às necessidades de amplificação de fragmentos longos. Além disso, a amplificação de fragmentos longos também requer o ajuste correspondente do desenho do primer, tempo de desnaturação, tempo de extensão, pH do tampão, etc. Normalmente, os primers com 18-24 bp podem levar a um melhor rendimento. A fim de evitar danos ao molde, o tempo de desnaturação a 94 ° C deve ser reduzido para 30 segundos ou menos por ciclo, e o tempo para aumentar a temperatura para 94 ° C antes da amplificação deve ser inferior a 1 minuto. Além disso, definir a temperatura de extensão em cerca de 68 ° C e projetar o tempo de extensão de acordo com a taxa de 1 kb / min pode garantir a amplificação eficaz de fragmentos longos.

A taxa de erro de amplificação por PCR pode ser reduzida usando várias DNA polimerases com alta fidelidade. Entre todas as Taq DNA polimerases encontradas até agora, a enzima Pfu tem a menor taxa de erro e a maior fidelidade (ver tabela anexa). Além da seleção da enzima, os pesquisadores podem reduzir ainda mais a taxa de mutação da PCR otimizando as condições de reação, incluindo a otimização da composição do tampão, a concentração da polimerase termoestável e a otimização do número do ciclo da PCR.