■ Alta eficiência de amplificação: fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (menores que 5 kb) e fontes podem ser amplificados com eficiência.
■ Alta sensibilidade: até 10 pg de fragmentos alvo podem ser amplificados a partir de modelos genômicos.
■ Alta resistência ao estresse: Para modelos com alto teor de impurezas, como modelo extraído áspero / cultura bacteriana, o fragmento alvo pode ser facilmente amplificado. A atividade da polimerase não será afetada por congelamentos e descongelamentos repetidos.
■ Conveniente para aplicações: O sistema de reação foi preparado de forma fácil e rápida. O fragmento amplificado contém a saliência 3 'da extremidade dA, que é conveniente para a clonagem de TA.
Modelo: Taq DNA polimerase
Amostra: Molde purificado / extraído em bruto / cultura bacteriana
Modelo: > 10 pg
Tamanho do fragmento: <5 kb
Formulários: Amplificação de fragmentos de DNA por PCR, marcação de DNA, extensão de primer, determinação de sequência, detecção de genes em grande escala, experimentos de PCR semiquantitativos, detecção de traços de DNA, etc.
Todos os produtos podem ser personalizados para ODM / OEM. Para detalhes,clique em Serviço personalizado (ODM / OEM)
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Figura 1. Modelos de fontes diferentes foram amplificados pelo TIANGEN Taq MasterMix II e pelo Taq Mix comum do Fornecedor TR, respectivamente, para detectar a resistência ao estresse dos reagentes. Os resultados mostram que os produtos TIANGEN podem amplificar os fragmentos alvo de modelos genômicos brutos e cultura bacteriana, e a resistência ao estresse é melhor do que a do Fornecedor TR. A: Molde genômico bruto extraído pelo kit TIANGEN TIANcombi DNA Lyse & Det PCR. Prp / DN: Extração bruta e detecção de amostras de sangue humano. Arroz: extração bruta e detecção de amostras de arroz. B: PCR de colônia. O fragmento de PCR tem 700 pb. M: Marcador TIANGEN III |
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Boa universalidade para modelos de diferentes fontes e com diferentes comprimentos Figura 2. Fragmentos de diferentes fontes e comprimentos foram amplificados usando TIANGEN Taq MasterMix II (A) e comum Taq Mistura de Fornecedor TK (B), Fornecedor TR (C), Fornecedor V (D) e Fornecedor G (E), respectivamente. Os resultados mostram que o desempenho abrangente dos produtos TIANGEN é o melhor em termos de capacidade de amplificação, especificidade e universalidade.M: TIANGEN Marker III1: Molde de DNA genômico de soja (120 bp); 2-3: molde de DNA genômico de arroz (694 pb, 2258 pb); 4: molde de DNA genômico de algodão (200 bp); 5: Escherichia coli molde de DNA genômico (2298 pb); 6-7: Modelo de DNA do genoma de camundongo (1 kb, 2 kb); 8-10: molde de DNA genômico de rato (1 kb, 2 kb, 2080 pb); 11-18: molde de DNA do genoma humano (300 pb, 448 pb (% GC: 74,8%), 1100 pb, 750 pb, 1000 bp, 1090 bp (GC%: 70,4%), 2 kb, 4 kb) |
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Alta sensibilidade Figura 3. Diferentes concentrações de fragmentos de DNA de rato e humano foram amplificados usando TIANGEN Taq MasterMix II (A), comum Taq Mistura de Fornecedor V (B) e Fornecedor TK (C), respectivamente, para detectar a sensibilidade de amplificação. Os resultados mostram que o produto TIANGEN pode amplificar o fragmento alvo do modelo do genoma tão baixo quanto 0,01 ng, e sua sensibilidade é melhor do que a dos produtos do Fornecedor V e TK.M: TIANGEN Marker III, N: NTCTemplate input 1-8 : 200 ng, 100 ng, 50 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, 0,01 ng. |
Modelo A-1
■ O modelo contém impurezas de proteínas ou inibidores Taq, etc. —— Purifique o modelo de DNA, remova as impurezas de proteínas ou extraia o DNA do modelo com kits de purificação.
■ A desnaturação do modelo não está completa —— Aumente apropriadamente a temperatura de desnaturação e prolongue o tempo de desnaturação.
■ Degradação do modelo ——Reprepare o modelo.
A-2 Primer
■ Baixa qualidade dos primers —— Sintetize novamente o primer.
■ Degradação do primer —— Aliquote os primers de alta concentração em um pequeno volume para preservação. Evite congelamento e descongelamento múltiplo ou criopreservação de 4 ° C por longo prazo.
■ Projeto inadequado de primers (por exemplo, o comprimento do primer não é suficiente, dímero formado entre os primers, etc.) -Redesign primers (evita a formação de primer dímero e estrutura secundária)
A-3 Mg2+concentração
■ Mg2+ a concentração está muito baixa —— Aumente o Mg de maneira adequada2+ concentração: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
Temperatura de recozimento A-4
■ A alta temperatura de recozimento afeta a ligação do primer e do template. ——Reduza a temperatura de recozimento e otimize a condição com um gradiente de 2 ° C.
Tempo de extensão A-5
■ Tempo de extensão curto —— Aumente o tempo de extensão.
Fenômenos: Amostras negativas também mostram as bandas da sequência alvo.
Contaminação A-1 de PCR
■ Contaminação cruzada da sequência-alvo ou produtos de amplificação ——Cuidado para não pipetar a amostra que contém a sequência-alvo na amostra negativa ou derramar para fora do tubo de centrífuga. Os reagentes ou equipamentos devem ser autoclavados para eliminar os ácidos nucléicos existentes, e a existência de contaminação deve ser determinada por meio de experimentos de controle negativo.
■ Contaminação do reagente —— Aliquote os reagentes e armazene-os em temperatura baixa.
A-2 Primer
■ Mg2+ a concentração está muito baixa —— Aumente o Mg de maneira adequada2+ concentração: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
■ Projeto de primer impróprio e a sequência alvo tem homologia com a sequência não alvo. —— Refaça os primers.
Fenômenos: As bandas de amplificação de PCR são inconsistentes com o tamanho esperado, seja grande ou pequeno, ou às vezes ocorrem bandas de amplificação específicas e bandas de amplificação não específicas.
A-1 Primer
■ Baixa especificidade do primer
—— Primer de redesenho.
■ A concentração do primer está muito alta —— Aumente adequadamente a temperatura de desnaturação e prolongue o tempo de desnaturação.
A-2 Mg2+ concentração
■ O Mg2+ a concentração é muito alta —— Reduza adequadamente a concentração de Mg2 +: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
Polimerase A-3 Termostável
■ Quantidade excessiva de enzima - reduza a quantidade de enzima de forma adequada em intervalos de 0,5 U.
Temperatura de recozimento A-4
■ A temperatura de recozimento está muito baixa —— Aumente apropriadamente a temperatura de recozimento ou adote o método de recozimento de dois estágios
Ciclos de PCR A-5
■ Muitos ciclos de PCR —— Reduza o número de ciclos de PCR.
A-1 Primer—— Especificidade pobre —— Desenhe novamente o primer, mude a posição e o comprimento do primer para aumentar sua especificidade; ou realizar PCR aninhado.
DNA de modelo A-2
——O modelo não é puro —— Purifique o modelo ou extraia o DNA com kits de purificação.
A-3 Mg2+ concentração
——Mg2+ a concentração é muito alta —— Reduza o Mg de maneira adequada2+ concentração: Otimize o Mg2+ concentração por uma série de reações de 1 mM a 3 mM com um intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg ideal2+ concentração para cada molde e primer.
A-4 dNTP
—— A concentração de dNTPs está muito alta —— Reduza a concentração de dNTP de forma adequada
Temperatura de recozimento A-5
—— Temperatura de recozimento muito baixa —— Aumente apropriadamente a temperatura de recozimento
Ciclos A-6
—— Muitos ciclos —— Otimize o número do ciclo
O primeiro passo é escolher a polimerase apropriada. A polimerase Taq regular não pode ser revisada devido à falta de atividade da exonuclease 3'-5 'e a incompatibilidade reduzirá muito a eficiência de extensão dos fragmentos. Portanto, a polimerase Taq regular não pode amplificar com eficácia fragmentos alvo maiores que 5 kb. A polimerase Taq com modificação especial ou outra polimerase de alta fidelidade deve ser selecionada para melhorar a eficiência da extensão e atender às necessidades de amplificação de fragmentos longos. Além disso, a amplificação de fragmentos longos também requer o ajuste correspondente do desenho do primer, tempo de desnaturação, tempo de extensão, pH do tampão, etc. Normalmente, os primers com 18-24 bp podem levar a um melhor rendimento. A fim de evitar danos ao molde, o tempo de desnaturação a 94 ° C deve ser reduzido para 30 segundos ou menos por ciclo, e o tempo para aumentar a temperatura para 94 ° C antes da amplificação deve ser inferior a 1 minuto. Além disso, definir a temperatura de extensão em cerca de 68 ° C e projetar o tempo de extensão de acordo com a taxa de 1 kb / min pode garantir a amplificação eficaz de fragmentos longos.
A taxa de erro de amplificação por PCR pode ser reduzida usando várias DNA polimerases com alta fidelidade. Entre todas as Taq DNA polimerases encontradas até agora, a enzima Pfu tem a menor taxa de erro e a maior fidelidade (ver tabela anexa). Além da seleção da enzima, os pesquisadores podem reduzir ainda mais a taxa de mutação da PCR otimizando as condições de reação, incluindo a otimização da composição do tampão, a concentração da polimerase termoestável e a otimização do número do ciclo da PCR.
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